Laboratoire d'analyse protéomique et de spectrométrie de masse

Analyse protéomique et spectrométrie de masse des produits biologiques

Au Centre d'évaluation des vaccins (CEV), nous avons développé une expertise scientifique dans diverses nouvelles techniques qui constituent de nouveaux outils pour l'évaluation des produits biologiques. La spectrométrie de masse et la protéomique sont nos approches clés pour l'étude des protéines.

 

Pourquoi étudier des échantillons et des mélanges de protéines?

Les protéines sont des éléments essentiels des produits biologiques, tels que les vaccins et les produits sanguins. Les protéines sont les ingrédients biologiquement actifs qui permettent au produit d'agir, tout comme l'acide acétylsalicylique (l'AAS) est l'ingrédient actif d'Aspirine®. Pour évaluer la qualité d'un produit biologique (par exemple, établir correctement les quantités d'ingrédients actifs ainsi que les impuretés), echantillons contenant un petit nombre de composés ainsi que des produits biologiques complexes, tels que les vaccins, doivent être caractérisée. Par ailleurs, il faut être en mesure d'étudier la grande variété de protéines présentes dans le sang ou les tissus pour découvrir les déterminants de la santé de l'organisme entier. Par exemple, la comparaison des taux normaux et anormaux d'un ensemble de protéines responsables d'une fonction particulière peut révéler une maladie ou un effet indésirable.

 

Comment nous étudions les échantillons de protéines au laboratoire d'analyse protéomique et de spectrométrie de masse

Au Centre d'évaluation des vaccins (CEV), l'expertise scientifique du Laboratoire d'analyse protéomique et de spectrométrie de masse est employée pour des problèmes exigeant l'analyse de protéines. Une approche clé consiste à mettre au point et à appliquer des méthodes fondées sur la spectrométrie de masse (SM) pour analyser des produits biologiques. L'expertise en recherche et en analyse scientifique du laboratoire est utilisée pour mettre en évidence les milliers de protéines qui sont présentes dans un échantillon ou exprimées dans un tissu ou un type de cellule donné. Il est également possible de caractériser en détail de petits ensembles uniques de protéines. Une approche permettant des analyses tant à grande qu'à petite échelle représente un atout majeur. Ainsi, lorsque se présente un problème urgent mettant en cause des milliers de protéines, l'approche protéomique fournit une précieuse vue d'ensemble de la situation au niveau des protéines et contribue à orienter la recherche d'une solution au problème biologique. Dans le cas des protéines purifiées, la séquence peptidique détaillée donne des indices précieux lorsque plus de renseignements sont nécessaires.
Les activités du CEV dans ce domaine contribuent à :

  • identifier et caractériser les ingrédients des produits biologiques pour fournir des renseignements sur leur qualité, leur innocuité et leur efficacité;
  • élaborer et améliorer des techniques pour l'étude des produits biologiques ultérieurs (PBU);
  • assurer une analyse rapide d'échantillons en situation d'urgence, comme lorsque surviennent des effets indésirables graves inattendus;
  • mettre en corrélation des maladies et des changements dans un protéome;
  • mettre au point et améliorer les techniques d'évaluation des vaccins.

La plupart des projets de SM portent sur la mise au point et l'utilisation de méthodes de séparation par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) directement couplée à la spectrométrie de masse en tandem (SM/SM) à haute résolution en vue d'identifier et de caractériser des mélanges complexes de composés organiques. Les substances à analyser peuvent être des glycoprotéines intactes, des peptides obtenus par digestion enzymatique d'une protéine (pour produire une carte peptidique), un protéome (l'analyse simultanée de multiples cartes peptidiques) ou encore des mélanges de médicaments contrefaits inconnus.

À l'heure actuelle, les projets de recherche du CEV qui font appel à la spectrométrie de masse se répartissent en deux catégories principales :

  • les projets de protéomique qui identifient et mesurer un grand nombre de protéines présentes dans des échantillons complexes;
  • la caractérisation de protéines recombinantes, qui comprennent la caractérisation de séquences peptidiques, des ponts disulfures et des modifications post-traductionnelles telles que sulfonation, phosphorylation et glycosylation.

 

Concepts et outils de la protéomique et de la spectrométrie de masse dans l'étude des produits biologiques

Au Centre d'évaluation des vaccins (CVE), nous utilisons la spectrométrie de masse (SM), une technique analytique extrêmement sensible qui permet de séparer et de mesurer exactement le rapport masse/charge (m/z) des ions.

Deux innovations spectaculaires récentes dans ce domaine ont permis l'application de cette méthode aux produits biologiques:

  • La mise au point de nouvelles méthodes d'ionisation telles que l'ionisation par électronébulisation (ESI) qui permet la production d'ions protéiques en phase gazeuse dans la portée massique de l'instrument;
  • Développements technologiques dans la séparation des ions en phase gazeuse, tels que les analyseurs de masse à temps de vol (TOF), qui permettent une mesure rapide et extrêmement précise de la masse des protéines et des peptides.

L'analyse à temps de vol consiste à accélérer un ensemble d'ions entre l'entrée du spectromètre de masse et le détecteur. Les principes fondamentaux de la physique font que les fragments plus légers (c'est-à-dire ceux dont la masse est plus faible) arrivent au détecteur en premier. Par conséquent, pour une population d'ions donnée, le temps écoulé entre l'accélération et la détection permet de calculer le rapport m/z des ions.

La combinaison de l'ESI et de l'analyse à temps de vol permet la détermination de la masse des particules ionisées ou chargées. Cependant, comme beaucoup de molécules différentes peuvent avoir un poids semblable, il est rare que la détermination de la masse à elle seule permette d'identifier un composé avec certitude. C'est pourquoi un paramètre additionnel est utilisé : la fragmentation des ions.

La méthode générale d'analyse par SM consiste à ioniser un échantillon dans une source d'ions pour produire à partir des molécules de l'échantillon des ions chargés en phase gazeuse. Les ions sont séparés selon leur rapport m/z dans un analyseur de masse. Pour examiner la fragmentation des ions, on utilise la SM en tandem (SM/SM). Dans cette approche, des ions ayant un rapport m/z particulier sont isolés puis fragmentés par collision en phase gazeuse. Les ions fragmentés ainsi obtenus sont alors analysés dans le spectromètre de masse. La SM/SM est couramment employée dans l'analyse des peptides. Elle permet de déterminer la séquence en acides aminés, ce qui est beaucoup plus utile que la masse pour l'identification des protéines.

La spectrométrie de masse est devenue une technique puissante pour l'étude des protéines en grande partie à cause de son extrême sensibilité. Les instruments actuels sont capables d'identifier des protéines en partant d'aussi peu que 10 femtomoles (0,000 000 000 2 g pour une protéine dont le poids moléculaire est de 20 000 g/mol).

Les applications de la SM comprennent:

  • l'identification des protéines;
  • la détection des contaminants dans des échantillons;
  • le séquençage des protéines (c'est-à-dire, l'établissement de l'identité et de l'ordre des acides aminés, qui sont les éléments constitutifs des protéines);
  • le reconnaître les changements qui se produisent dans les protéines après qu'elles ont été traduites à partir du génome (les modifications post-traductionnelles), tels que la phosphorylation et la glycosylation.

La protéomique est l'étude de l'ensemble des protéines exprimées dans une cellule, un tissu ou un organisme particulier. Ces ensembles complets de protéines sont appelés protéomes. Beaucoup de facteurs influencent le type, la structure et la concentration des protéines qui sont exprimées et présentes. Les changements dans un protéome peuvent avoir des effets variés.

L'étude du protéome comprend:

  • la séparation et l'identification des protéines;
  • la détermination de la concentration relative des protéines;
  • l'examen de la composition en acides aminés des protéines;
  • la détermination de la structure des protéines;
  • l'étude des interactions entre les protéines.  

Cette méthodologie peut être appliquée tant aux composés naturels tels que le sang qu'aux produits thérapeutiques comme les produits biologiques, qui peuvent contenir des milliers de protéines. Ainsi, le plasma sanguin contient des milliers de protéines différentes dont la concentration varie d'un facteur de l'ordre de1012; par ailleurs, le protéome d'un vaccin monovalent contient un nombre et une gamme dynamique de protéines bien inférieurs à ceux de l'organisme ciblé.

 

Point saillant de la recherche 1 : Détection de contaminants - réponse rapide aux demandes relatives aux effets indésirables et aux impuretés

Au Centre d'évaluation des vaccins (CEV), l'expertise scientifique en séparation est utilisée pour produire rapidement une analyse détaillée des composés d'un échantillon biologique. Elle permet d'établir et de confirmer la présence d'un contaminant dans un produit. Grâce à cette expertise, il est possible d'analyser un échantillon pour déterminer ce qu'il contient et la quantité de chaque composé. À titre d'exemple, une impureté inhabituelle a été découverte dans l'hormone de croissance humaine; il s'est avéré qu'il s'agissait d'une modification de la protéine consistant en l'ajout d'un atome de soufre dans un pont disulfure. Dans la plupart des cas, un ensemble d'échantillons recueillis en raison d'un effet indésirable sont comparés à des échantillons normaux. Toute composante anormale est notée et identifiée, habituellement par spectrométrie de masse en tandem (SM/SM). Ensuite, l'impureté est isolée et son identité est confirmée par résonance magnétique nucléaire (RMN). La combinaison de la SM/SM et de la RMN constitue une approche extrêmement puissante pour résoudre les problèmes de structure et d'identification.

Le Laboratoire d'analyse protéomique et de spectrométrie de masse s'emploie à :

  • identifier de possibles contaminants dans des lots de produits (d'emblée ou en réponse à des rapports d'effets indésirables) afin de détecter les produits contaminés ou dangereux, d'en prévenir la circulation et/ou de les rappeler;
  • mettre au point de nouvelles techniques de détection pour caractériser les produits biologiques, qui peut aider à mettre à jour et améliorer les normes nationales et internationales relatives aux ingrédients actifs et aux produits;
  • produire rapidement des analyses précises, afin de fournir des renseignements cruciaux permettant à d'autres intervenants de résoudre des problèmes de santé; nous contribuons à protéger la population des produits dangereux et à réduire les effets indésirables.

 

Point saillant de la recherche 2 : Diagnostic de maladies par la protéomique - le syndrome plaquettaire du Québec

Le Centre d'évaluation des vaccins (CVE) s'applique leur expertise dans la séparation des protéines à l'étude des produits sanguins et le sang et les produits biologiques. Par exemple, l'expertise dans les méthodes protéomiques permis de diagnostiquer une maladie du sang rare - le syndrome plaquettaire du Québec (SPQ).  La maladie a d'abord été mise en évidence dans une petite population du Québec. La génétique médicale montre que le SPQ est un trouble génétique rare de la coagulation sanguine. Étant donné que la maladie est rare et que son diagnostic n'est pas évident, il peut être difficile de la détecter, surtout à l'extérieur de la région où la maladie a été initialement découverte. Quand une famille de patients de Colombie-Britannique a présenté des symptômes hémorragiques inhabituels, les scientifiques du CEV ont collaboré avec les chercheurs de la Société canadienne du sang et ont procédé à une analyse protéomique des protéines des plaquettes sanguines qui a révélé des anomalies dans les concentrations de certaines protéines. Ces renseignements ont été essentiels pour identifier le trouble dont souffraient ces patients.

Les travaux dans ce domaine indiquent que :

  • la recherche en protéomique peut contribuer au diagnostic de certaines maladies en réduisant les possibilités à un trouble présentant une corrélation avec des changements spécifiques dans la concentration de certaines protéines;
  • les études protéomiques sont utiles pour établir quelles protéines sont associées à une maladie ou en sont la cause. Dans le cas des maladies rares, le diagnostic peut être très difficile. En fournissant des renseignements complémentaires sur la distribution et l'expression des protéines, nous pouvons fournir les éléments additionnels nécessaires au diagnostic.

 

Point saillant de la recherche 3 : Nouvelle méthode rapide et efficace pour l'évaluation des vaccins antigrippaux par une approche protéomique

La grippe est une infection respiratoire causée par le virus de la grippe. Se faire vacciner contre la grippe annuelle peut aider à prévenir une infection ou à réduire la sévérité de la maladie.

Les vaccins antigrippaux annuels sont composés d'un mélange de protéines provenant de trois souches virales : les protéines de deux souches de type A et d'une souche de type B. Protéines de la grippe sont les ingrédients clés du vaccin. Pour produire des protéines de la grippe, les souches de virus différents sont cultivés dans des oeufs de poulet et sont ensuite purifiés par des méthodes de laboratoire. En conséquence, protéines d'oeuf résiduelle peut être présente dans les vaccins.

Le virus de la grippe mute très rapidement, ce qui explique pourquoi il est nécessaire d'amorcer notre système immunitaire avec le vaccin contre la grippe de cette saison. Chaque année, l'Organisation mondiale de la santé indique quelles souches devraient être utilisées. Les autorités réglementaires fournissent ensuite les souches initiales que les fabricants utiliseront pour la production des vaccins antigrippaux annuels. Pour s'assurer que les vaccins contiennent les bons ingrédients, un test à base d'anticorps est utilisé La préparation de cet anticorps demande jusqu'à six semaines. Les scientifiques du Centre d'évaluation des vaccins (CEV) ont mis au point une nouvelle approche basée sur la protéomique pour évaluer les vaccins. L'expertise en spectrométrie de masse (SM) et en analyse de protéines est utilisée pour établir quelles souches sont présentes dans le vaccin. Grâce à cette expertise, les protéines du virus de la grippe dans le mélange peuvent être identifiées en moins de trois jours.

Les travaux dans ce domaine :

  • permettent l'analyse de vaccins antigrippaux sans anticorps, lesquels prennent habituellement six semaines à produire;
  • offrent une capacité accrue de détecter les protéines d'œuf restantes, qui présentent un risque d'allergie/d'effets indésirables pour certaines personnes;
  • mènent à des méthodes d'évaluation des vaccins de rechange rapides en cas de pandémie.

 

Pour des renseignements au sujet du chercheur scientifique responsable de ce laboratoire, veuillez visiter son  profil dans le Répertoire des scientifiques et des professionnels

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